Decimoséptima semana (16/10/08)

Hicimos una reacción de ligación.
Preparamos dos tubos, uno con H2O, Buffer, vector, inserto y la ligasa, y el otro igual pero sin el inserto, esto va a servir para poder verificar que las dos puntas del vector no se hayan unido de vuelta. Lo dejamos en un baño de agua a 26ºC durante una hora para que se ligue correctamente el inserto con el vector. Luego procedimos con el siguiente protocolo:
Transformación de E. coli
1. Poner 100 ml de células competentes y 20 ml de rx de ligación en un eppendorff estéril. Hacer control con 100 ml de células competentes y 0.5 ml de plásmido control (purificado x kit QUIAGEN)
2. Incubar 30 minutos en hielo
3. Incubar 2 minutos a 42 ˚C
4. Incubar 5 minutos en hielo
5. Agregar 1 ml (o 450 ml) de medio LB sin Ampicilina
6. Incubar 1 hora a 37 ˚C a 225 rpm
7. Centrifugar las células y resuspender el pellet en el sobrenadante restante
8. Sembrar todo el contenido de cada tubo en placas con medio LB + AmpicilinaColocar en estufa a 37 ˚C

Decimosexta semana (02/10/08)

Hicimos PCR para amplificar el inserto (800 pb del promotor de UGA3), y cortamos con enzimas de restruccion (EcoRI y BamI). Al tubo del vector le agregamos la fosfatasa y dejamos en la estufa a 37ºC durante hora y media para que se desfosfate bien. Luego purificamos con tres soluciones buffer el vector y el inserto.
Preparamos un gel de agarosa donde pusimos los insertos y dejamos correr.

Decimoquinta semana (25/09/08)

Hicimos de nuevo las transformaciones de hace dos semanas, ya que algunas presentaban hongos y demás contaminaciones.
Procedimos de igual manera;
crecimos las cepas en placas de medio rico,limpiamos, centrifugamos, usamos una solución que nos ayuda a que el plásmido entre en la célula, incubamos y plaqueamos.

Decimocuarta semana (18/09/08)

Observamos los resultados de la anterior semana.
Usamos el plásmido que purificamos en una de las semanas y lo cortamos con una enzima de restricción (HindIII). Lo hicimos por duplicado.
Esto se llama hacer una digestión de un plásmido. Se usa un buffer específico, las enzimas, el plásmido y se rellena con agua. Luego se coloca a 37°C durante el periodo de una hora y media.
En un gel de agarosa 8% m/v corrimos el plásmido sin digerir en diferentes concentraciones y los dos plásmidos digeridos también en diferentes concentraciones.

La imagen muestra en los dos primeros pocillos los plásmidos sin digerir (las dos bandas que se observan pertenecen a las dos formas en las que esta CCC (que predomina) y la OC (una de las cadenas se rompió dejando al plásmido en un estado relajado). Los siguientes pocillos muestran al plásmido una vez digerido en diferentes concentraciones, donde se ve una banda que pertenece al estado del plásmido lineal (las dos cadenas cortadas). Al final está el marker y lo usamos para medir la cantidad de pares de bases y así asegurarnos de que todo corrió correctamente.

Decimotercera Semana (04/09/08)

Este día transformamos células al introducimos plásmidos adentro. En éste caso las células a transformar eran ura-, osea que no crecen en un medio sin uracilo. Él plásmido que les introducimos les da el gen ura3 con la capacidad de generar su propio uracilo, por lo tanto los que lo incorporen van a sobrevivir en el medio uracilo-.
Para llevar a cabo todo esto:
-crecimos las cepas en placas de medio rico
-resuspendimos células en 1 ml de agua estéril y centrifugamos
-descartamos el sobrenadante y resuspendimos en el liquido remanente
-agregamos una solución que nos ayuda a que el plásmido entre en la célula (sumado al hitshock del siguiente paso)
-de la suspensión celular pasamos 20microl a otro eppendorf y le agregamos el ADN plasmidico
-los incubamos 30 minutos a 42°
-agregamos 1ml de agua esteril, centrifugamos para bajar las células
-y plaqueamos en el medio

Introducción

Dilucidar los eventos moleculares desencadenados en respuesta a cambios en la disponibilidad de nutrientes, analizando procesos de regulación génica en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae

Cualquier célula necesita distintos tipos de nutrientes para su crecimiento. Las células son capaces de sensar los cambios en los nutrientes del medio de crecimiento y adaptarse a ellos. Así, los procesos que median las diferentes respuestas celulares ocurren secuencialmente y son: recepción, transducción y respuesta. La recepción implica el sensado de los distintos nutrientes por proteínas presentes en la membrana plasmática de las células. La transducción es el mecanismo por el cual la o las señales son enviadas al interior de las células generando una respuesta celular, que puede ser la activación de enzimas de algún camino metabólico particular y/o activar la transcripción de genes específicos.
Cada célula posee en su interior un núcleo que contiene, entre otras cosas, la información (ADN) para que ésta pueda funcionar debidamente. Esta información a su vez, se subdivide en pequeños segmentos, en paquetes que son llamados genes. Cada gen, luego de ser transcripto y traducido, produce una proteína en especial; es decir, cada gen tiene la suficiente información para poder sintetizar a una proteína.

Como modelo experimental, se utilizarán células de la levadura Saccharomyces cerevisiae que es un organismo eucariota unicelular no patógeno, de fácil manipulación, de rápido crecimiento en medios de cultivos definidos y cuya secuencia genómica completa es conocida. Teniendo en cuenta la conservación evolutiva de las vías de señalización disparadas en respuesta a los nutrientes del medio, el uso de S. cerevisiae como modelo para el estudio de transducción de señales permitirá esclarecer el gran desafío que es conocer cómo señales producidas por nutrientes presentes en el medio extracelular se integran y son coordinadas por las células.

En esta imágen se puede ver una célula de levadura gemando (reproduciéndose asexualmente).

Se puede observar tambien el núcleo y su vacuola.

En el laboratorio se estudia la regulación del gen UGA4, que constituye un excelente modelo para estudiar la respuesta génica a cambios en el medio extracelular ya que está sujeto a una regulación muy compleja y además algunas de las proteínas claves involucradas en esta regulación se encuentran conservadas desde las levaduras hasta el hombre. Este es el caso, por ejemplo, de los factores de transcripción de la familia GATA, varios de los cuales son muy importantes en la regulación de UGA4, y también de la proteína TOR1, kinasa que posee un rol central en el control del crecimiento en respuesta a la disponibilidad de nutrientes tanto en levaduras como en moscas y células de mamíferos1,2.
UGA4 es el gen que codifica para la proteína Uga4. Esta proteína es una permeasa que se encuentra en la membrana plasmática y permite la incorporación de los ácidos d-aminolevúlico (ALA)3,4 y y-aminobutírico (GABA)5,6.

ALA no tiene ninguna función biológica que sea imprescindible para la célula, es incorporado por ésta a causa de su estructura, la cual es similar a la del GABA.
El GABA puede ser utilizado por las células de levadura como fuente de nitrógeno, pero es una fuente pobre, en comparación con fuentes ricas de nitrógeno como amonio. Hay factores que influyen en la represión o en la inducción de la expresión del gen, dependiendo de la situación en la que la célula se encuentre. El gen se va a expresar sólo en ausencia de una fuente rica en nitrógeno (como amonio); en ausencia de este tipo de fuente, la célula desencadena mecanismos para poder sobrevivir en dichas condiciones. En la secuencia promotora del gen UGA4 hay dos sitios importantes conocidos como UAS-GABA y UAS-GATA. En cada uno de ellos influyen factores que al pegarse reprimen o inducen su expresión. La expresión del gen UGA4 depende de la presencia de un inductor, GABA5,7. La inducción requiere la acción de dos factores de transcripción, uno específico, Uga3, y otro pleiotrópico, Uga35, que actúan a través de una secuencia activadora rica en los nucleótidos GC (UASGABA)8,9. La región regulatoria del gen UGA4 contiene también cuatro repeticiones adyacentes del heptanucleótido 5´-CGAT(A/T)AG-3´ que constituye un elemento UASGATA. Sobre este último actúan los factores GATA que pueden actuar como factores positivos y negativos. Los factores negativos (Uga43 y Gzf3) compiten con los positivos (Gln3 y Gat1) y el que “gana” se pega al promotor del gen. Cuando hay una fuente rica de nitrógeno presente, la célula no gasta energía sintetizando proteínas que transporten GABA8,10,11, los factores positivos. Gln3 y Gat1, se encuentran en el citoplasma unidos a la proteína Ure2, no pueden actuar sobre el elemento UAS-GATA, y por ende, los factores negativos “ganan”, lo que lleva a la represión de la expresión de UGA4. En este caso los factores negativos se unen al sitio UAS-GATA.

Cuando no hay una fuente rica pero sí hay GABA en el medio, la célula se adapta al cambio y activa toda la maquinaria para sintetizar la proteína Uga4; en otras palabras, GABA induce la expresión del gen UGA45,7,9. Los factores positivos se disocian de Ure2 y se translocan al núcleo donde desplazan a los factores negativos uniéndose al promotor y permitiendo la expresión del gen9,12. La interacción entre los factores positivos Gln3 y Gat1 con Ure2 está modulada por el estado de fosforilación de estos factores que a su vez depende de la actividad kinasa de Tor13-15.
El objetivo principal de esta pasantía es la familiarización con distintas técnicas de biología molecular mediante la participación en un proyecto en el cual se estudia la cascada de señales que lleva a la regulación de la expresión del gen UGA4 por aminoácidos extracelulares. Los mecanismos moleculares en dicha cascada de señales no se conocen por completo pero se sabe que el complejo sensor SPS está involucrado.
Este complejo se conoce como SPS16-18 por sus tres componentes proteicos (Ssy1p, Ptr3p y Ssy5p) y se activa luego del sensado de aminoácidos extracelulares y posiblemente intracelulares19. Ssy1 es una proteína de membrana que se asemeja a una permeasa de aminoácidos pero funciona únicamente como sensor. Ptr3 y Ssy5 interactúan con Ssy1 formando un complejo proteico dinámico. Se ha determinado un número importante de genes regulados por la actividad de este sensor y muchos de estos genes codifican para proteínas involucradas en el transporte de aminoácidos. Entre ellos, BAP2 y AGP1 responden a aminoácidos vía SPS a través de los factores de transcripción Stp1, Stp2 y Uga3520.

Los factores Stp1 y Stp2 actúan, en respuesta al sensado de aminoácidos extracelulares, sobre elementos UASaa presentes en promotores de permeasas, como por ejemplo BAP2 y BAP3. Es importante destacar la gran similitud de secuencia entre los elementos UASaa y el UASGABA21,22. Stp1 y Stp2 se sintetizan como factores latentes y permanecen retenidos en el citoplasma a través del dominio regulatorio amino terminal. También tres proteínas presentes en la membrana nuclear interna, Asi1, Asi2 y Asi3, participan en la retención de Stp1 y Stp2 latentes en el citoplasma23,24. En respuesta a aminoácidos, Ssy1 activa a la proteasa Ssy5 a que a su vez cliva el dominio regulatorio de Stp1 y de Stp2, llevando a la activación de estos factores. Sus formas procesadas son transportadas al núcleo donde transactivan genes regulados por SPS20,25-27.


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Decimosegunda semana (14/08/08)

Seguimos trabajando en la Introducción.